Re: [escepticos] Prueba del ADN

[Adela Torres <torresad@...>]

Cachis, para una vez que puedo decir algo resulta que me tengo que largar una
semana. Bueno, tanto da, aquí va esto para lo que sirva:

snake wrote:

> Ya que ha salido el tema, y aprovechando que en la lista hay varias personas
> tecnicas en la materia, queria preguntaros acerca del proceso de
> secuenciacion del DNA. Me interesa mas que los enzimas o soluciones que se
> usen,  sobre todo la fase en que se pasa del nivel micro (quimico), al nivel
> macro (simbolico), y si esta es automatizable. Supongo que deberia usarse
> algun tipo de sensor, quizas quimico, o electrico.
> En fin, gracias a todos.

  Para no perdernos en parrafadas teóricas sobre la técnica de secuenciación que
se usa ahora mismo, voy a supersimplificar y que me perdonen los dioses de la
biología molecular.
Para secuenciar el ADN lo que se hace es aprovechar que este esta formado por
dos "hebras" o "cadenas" complementarias, de manera que se puede generar una
partiendo de la otra como molde. Para un fragmento de ADN de determinada
longitud, es posible generar todas las longitudes de cadenas "hijas" posibles,
desde 1 sólo "eslabón" (nucleótido) de la cadena hasta la totalidad. La razón
para poder hacer esto es que existe una técnica que permite separar por temaño
los fragmentos de ADN, de tal manera que se pueda distinguir entre una cadena de
longitud N y una de longitud N+1. ¿Y por qué esto es útil? Porque mediante
técnicas de marcaje (luego voy a esto) es posible saber cuál es el último
eslabón de esa cadena. Así que tenemos un montón de fragmentos de los cuales
sabemos el último eslabón, y además los tenemos ordenaditos por tamaños. Si
vamos mirando los fragmentos por orden ascendente, del más corto al más largo,
podremos ir "leyendo" la secuencia: el primer fragmento, el más corto, acaba
digamos que en T. El siguiente, que es sólo un eslabón más largo, acaba en A, el
siguiente en C, y así sucesivamente, y vamos formando la secuencia (TAC en este
caso).

Bueno, ¿y cómo "vemos" en qué eslabón termina la cadena? Hay varias
posibilidades. Me voy a referir al la más usada en técnicas automatizadas.

Para poder generar todos esos fragmentos de longitud diferente, necesitamos que
la cadena termine en uno u otro nucleótido. Lo que se hace es lo siguiente: se
prepara una mezcla de reacción en la que esté la cadena "molde" de la que se va
a sacar la población de fragmentos, y los "ladrillos" necesarios para formar las
nuevas cadenas hijas, truncadas. Estos "ladrillos" son de cuatro tipos, como
todos saben, A, C, G y T. Fale. Pero es que entre las As que se ponen hay una
proporción (pequeña pero muy hábil ella) de As modificadas de dos maneras: una
modificación hace que, una vez que se hayan unido a la cadena en formación, ya
no se puedan unir los demás "eslabones", así que esa cadena termina en A por...
por narices. Otra, es que esa molécula lleva añadido un marcador, generalmente
un fluoróforo: una molécula que emite luz al ser excitada por ciertas longitudes
de onda. Es posible diseñar fluoróforos de muchos colorines, así que cada tipo
de "ladrillo" lleva un color diferente.
Es fácil ver a dónde llega todo esto: cuando tenemos separados los fragmentos
por tamaño, todos ellos se verían como una larga serie de rayitas
indistinguibles, de no ser por los colorines, que nos permiten saber quién está
en cada sitio. Así que leyendo los colores por orden, como quien lee un
muestrario de tapicerías, sabemos la secuencia, sólo que en lugar de
rojo-naranja-azul-verde o lo que sea, leemos ATGC.

Buenooo... "banditas", "colorines"... ¿cómo se ve eso? Snake preguntaba si es
posible automatizar eso. Ya lo creo que lo es, si no, no habría Proyecto Genoma
que valga. Existen secuenciadores automáticos muy eficaces. El técnico prepara
un gel de acrilamida: una matriz en la que las moléculas de ADN puedan separarse
por tamaños. Esto se consigue aplicando un campo eléctrico, y a la técnica se le
llama "electroforesis", pero no me extiendo, que aquí hay más y mejores
especialistas. Las muestras, con todos sus fragmentitos de diferentes tamaños,
se cargan en el gel (está en posición vertical, y las muestras se cargan en la
parte superior) y luego ya es cosa del aparato. Lo que ocurre es lo siguiente:
en la parte inferior del gel, que puede medir desde veintipocos a 60 cm o más,
hay un sensor que detecta las emisiones de los diferentes fluoróforos con que
están marcados los nucleótidos. A estas alturas, los fragmentos ya están
separados y el sensor los va "leyendo" a medida que van llegando (los más
pequeños primero, que son más "ligeritos" y "corren más"). Los datos son
traducidos por un ordenador, que los muestra en la pantalla en varias formas,
según los aparatos: bien como un fluorograma con picos de intensidad de cada
tipo de señal, o bien directamente escribiendo la secuencia.

No sé hasta qué punto me he explicado o me he liado, y a los interesados de
rebote. La pena es que de aquí a hora y media me piro una semana de congreso. No
me voy a desuscribir (horror, locaaaaa) por si acaso encuentro un ordenador
potable para leer las correcciones pertinentes.

Saludos,

Adela

P.S. Pa los que saben más: lo que he descrito es más o menos el funcionamiento
del ABI, el secuenciador más conocido y usado. Yo conozco mejor otros como el
Li-COR, que usa una técnica ligeramente distinta, así que puede que haya metido
la pata.